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千两茶有效抑制老年色素物质生成实验记录

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-05-16 来源:安化黑茶收藏协会 作者:刘仲华 浏览次数:330
 千两茶有效抑制老年色素物质生成实验记录

    老年色素(Age pigment),即老年斑,也称脂褐素,是毒性羰基化合物与蛋白质的羰-氨交联反应所形成的产物,是细胞衰老过程中出现的特征性物质,其含量增加反映了细胞老化的程度。由于这些反应产物具有稳定的化学刚性结构,不易消除,在疾病和炎症过程中机体堆积了大量的这类生物垃圾。

蛋白质产物荧光强度检测分析

       毒性羰基化合物丙二醛(MDA)能与人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)通过羰氨交联反应生成老年色素荧光团(APFs)。本研究从HSA/MDA反应体系中吸取1.0ml,再磷酸缓冲溶液稀释5倍,然后置于96孔板中,在酶标仪上检测在395nm波长的激发下发射波长为460nm的荧光强度,评价千两茶对APFs生成的抑制活性。为排除MDA的交联聚合和儿茶素样品对荧光检测产生的影响,检测之前,对蛋白质样品做如下处理:取0.5mL的样品,与1/5反应体系总体积的20%三氯乙酸(TCA),加入到1.5mL的离心管中,充分混匀,于11,000g离心力作用下离心3min;离心后弃去上清液,取0.5mL的磷酸缓冲溶液和0.1mL的20%TCA加入到前次离心得到的沉淀中,充分混匀,于11000g离心力作用下离心3min;重复一次(即共3次离心)以确保将样品中的杂质(特别是MDA)完全除去;最后将通过3次离心得到的沉淀(即HSA)溶解于1.0mL的磷酸缓冲溶液中。

        从上图可见,在本研究的实验浓度范围内(120~360ug/mL),千两茶随着使用浓度的提高,对APFs生成的抑制作用逐渐增强,而且在低、中、高(120、240、360ug/mL)三个剂量条件下都非常显著地抑制了APFs生成。

蛋白质产物的红外光谱分析
        蛋白质是一类与生命相关的生物大分子,在正常情况下以紧密折叠结构存在。天然蛋白质分子受到外界条件影响,使其生物活性丧失,溶解度降低,不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变,这种过程称为蛋白质变性。蛋白质在变性过程中,一般蛋白质一级结构保持完好,其二级结构会发生变化。蛋白质二级结构是指多肽链骨架的局部空间结构,不考虑侧链的构象及整个肽链的空间排列,常见的二级结构有a-螺旋、b-折叠等规则结构,转角、环形等半规则和卷曲无规则结构等。各类二级结构主要是由肽链骨架上羰基上的氧原子和亚胺基上的氢原子之间的氢键所维系,其他作用力如范德华力、配位键、二硫键等也有一定贡献。博里叶变换红外光谱(FTIR)作为最近20年发展起来的一种新的分析测试技术,在研究蛋白质变性方面具有独特的优势。


        在蛋白质变性过程中,酰胺I带(吸收谱1600至1700cm-1区域NH-CO)的吸收谱主要来源于这个谱带中酰胺C=O键的伸缩振动(大约80%)。酰胺C=O上的氢键越强,其电子密度将越小,相应地酰胺I带的吸收谱地越小。如下图所示,在MDA/HAS反应体系中,羰-氨交联反应导致了蛋白酰胺I带吸收峰值的降低,加入千两茶提取液孵育后,能够很好地逆转这种变化趋势,形成了与下图类似的图谱。由此可见,在MDA/HAS反应体系中,千两茶能够有效地抑制蛋白发生羰-氨交联反应。

        蛋白质二级结构的定量分析结果如上图所示,MDA修饰HAS后,蛋白质a-螺旋的含量由20.59%降至10.76%,b-折叠由25.58%降到8.11%,a-螺旋和b-折叠的相对百分含量逐渐减少,b-转角和无规卷曲的相对百分含量则增加,整个分子构象由有序向无序转化,直至出现聚合沉淀。在反应体系中分别加入千两茶后,a-螺旋和b-折叠的含量显著增高,接近正常组,这意味着蛋白质发生羰-氨交联反应后,结构倾向于从有序态转变为无序态,而千两茶能有效阻止或逆转这个过程,表现出显著的抗衰老活性。(作者:刘仲华,资料来源:安化黑茶收藏协会,转载链接:https://mp.weixin.qq.com/s/-nWiypt7Vm_GnlK4qpj5Cg)

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